农药降解菌的分离、鉴定及其性能分析
实验方案
实验一 农药降解菌的富集
一、实验原理
原始混合试样中含有各种各样的微生物类群，而对其中数量很少的一类微生物，如果按照常规直接用平板划线或稀释涂布平板法进行分离，必难以奏效。
富集培养是指从微生物的混合群开始，对原本数量很少的特定种微生物采取某些措施使其数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法。在适于目标微生物生长而不适于其他微生物生长的条件下继续培养，则目标微生物将成为优势种而得到纯培养。
通过连续富集培养的方法分离降解农药的微生物，可以农药作为唯一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含农药的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时在每次转接时将农药的浓度逐步提高，便可得到降解该农药占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，便可得到能降解高浓度农药的微生物。
二、实验用品
1、材料：豆磺隆/氯氰菊酯、受污染的土壤样品
2、器材：恒温摇床、移液器、接种环、涂布棒
3、培养基：富集培养基、基本培养基
4、试剂：豆磺隆/氯氰菊酯、移液器、涂布棒、
三、实验步骤
1. 培养基的配制
富集培养基（LB）：蛋白胨10克，NaCl5克，酵母膏（粉）5克，蒸馏水l L，pH 值7.0。
基础培养基：葡萄糖5.0g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4 0.5g，NaCl0.2g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2 0.1 g, 蒸馏水 1000mL， pH7.0；
2. 取经常使用豆磺隆的菜园土壤 2.0g(或者以取自烟嘧磺隆农药生产厂污水处理系统中的活性污泥作为最初的接种物5g)，于 100ml 富集培养基中，豆磺隆浓度为 100mg/L，置于 30℃，180rpm 摇床培养。以后每隔大约一周，以接种量 10%接入新鲜培养液中，并逐渐提高豆磺隆用量，至培养液中的豆磺隆浓度达到 500mg/L，然后用基础培养基代替富集培养基，每隔 1-2 周移种一次，豆磺隆的浓度仍为 500mg/L。如此驯化 2 周以上，最后用平板划线法在含豆磺隆100mg/L的基础培养基上分离好氧性降解菌。
四、注意事项
在富集培养过程中，不断提高农药的浓度；并在每次转接提高农药浓度时，吸取定量富集液稀释涂布平板。
实验二 农药降解菌的分离纯化
一、实验原理
平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在固体平板培养基表面通过分区划线稀释而得到由单个细胞经培养生长形成的单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都是由单个细胞繁殖而来的，故必须反复划线分离多次才可得到纯种。
划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C区）是逐步稀释的过渡区，第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D>C>B>A。
二、实验用品
1、材料：实验一中的菌落平板
2、器材：培养箱、水浴锅、无菌培养皿、接种环
3、培养基：基本培养基、牛肉膏蛋白胨培养基
4、试剂：农药（豆磺隆）
三、实验步骤
1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2 只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基 一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D 四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用 这种分区法可使D 区与A 区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
4．划线操作： (1)挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。 (2)划A 区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿盖朝上，仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环先在A 区划3—4 条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少而定)。划完A 区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方 (不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。 (3)划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B 区转到上方，接种环通过A 区(菌源区)将菌带到B 区，随即划数条致密的平行线。再从B 区作C 区的划线。 最后经C 区作D 区的划线，D 区的线条应与A 区平行，但划D区时切勿重新接触A、B 区，以免该两区中浓密的菌液带到D 区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
5．恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24h 后观察。
四、注意事项
平板划线分离过程中要严格无菌操作，防止杂菌污染。
实验三 农药降解菌的16S rDNA鉴定
一、实验原理
16S rDNA鉴定（16S ribosomal DNA identification）是指利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。主要步骤包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤，是一种快速获得细菌种属信息的方法。原核生物rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA，其核苷酸数分别为120、1540、2900个。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟。
选用16S rRNA作为生物进化和系统分类研究具有以下优点：
①16S rRNA普遍存在于原核生物中。②16S rRNA在细胞中的含量较高、较易提取。③16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，所包含的信息量大，便于序列分析，适用于各级分类单元，是测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具，已被广泛应用于微生物系统分类和进化研究中。④16S rRNA核苷酸序列高度保守，在进化过程中变化很慢，它既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究，可作为生物演变的时间钟。⑤可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
二、实验用品
1. 菌株
分离筛选的培养至对数生长期的菌体细胞
2. 器材：水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪、紫外成像仪、移液器、无菌枪头（1ml,200µL, 10µL）、1.5ml离心管、无菌牙签、生物信息学软件
3. 试剂
溶菌酶、10%SDS、蛋白酶K、醋酸钾、无水乙醇、TE缓冲液、Taq酶，dNTPs，琼脂糖
16 S rDNA引物：采用细菌16S rDNA通用引物，由上海生工合成，引物序列为：27F：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT。
三、实验步骤
1、菌落PCR扩增细菌16 S rDNA
A扩增体系为：
挑取少许菌体作为模板 0.5 μl
10×PCR Buffer 2.5 μl
dNTP （2.5mM） 2 μl
MgCl2 （25 mM） 2 μl
Primer F（50μM） 0.25 μl
Primer R（50μM） 0.25 μl
EXTaq （5U/μl） 0.2 μl
ddWater 17.3 μl
反应程序为：PCR程序：94℃4 min;94℃30 sec,55℃1 min,72℃90 sec 共35个循环;72℃10 min；4℃终止反应。
B扩增体系为：
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10×buffer |
2.5μL |
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d NTP（2.5mM） |
2.0μL |
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MgCl2 |
2.0μL |
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引物上F（10μM） |
1.0μL |
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引物下R（10μM） |
1.0μL |
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Taq酶（5U/μl） |
0.5μL |
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ddH2O |
16μL |
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挑取少许菌体作为模板 |
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总体系 |
25μL |
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反应程序为：PCR程序：
94℃7 min;
94℃ 30 sec,
55℃ 1 min, 共30个循环;
72℃60 sec
72℃ 10 min；
4℃终止反应。
2、电泳分析扩增结果
PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测是否产生1.5 kbp的条带。
3、测序
填写测序单，送公司测序，等待测序结果
4、序列比对、分析及系统进化树的构建
PCR产物完成测序后，在NCBI(http://blast.ncbi.nim.gov/Blast.cgi/)、RDP、Eztaxon数据库进行比对，再从RDP数据库(http://rdp.cme.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp) 或Eztaxon数据库中下载相近的模式菌株序列，运用ClustalX1.83进行多重序列比对分析后，用MEGA4.0构建系统进化树。判断细菌种类。使用软件sequin将测序序列提交到NCBI，获取Genebank登录号。
四、注意事项
16S rDNA鉴定是基于PCR的鉴定方法，PCR过程中容易污染，获得假阳性结果，应注意做好阴性对照。
实验四 农药降解菌的降解性能分析
一、实验原理
土壤中微生物（包括细菌、霉菌、放线菌等各种微生物）对有机农药的降解起着重要的作用。微生物一般以两种方式降解农药：①以农药作为生长的唯一碳源和能源，有时也以农药为唯一氮源，使农药降解；② 通过共代谢作用，即微生物从其他化合物获得碳源和能源，也能使农药转化甚至完全降解。温度、酸碱度、盐浓度度、碳氮源种类、溶氧量、有机质含量等环境因素的改变必然会影响微生物的生长速度及代谢活性，进而会影响微生物对农药的降解效率。
本实验通过设置温度、酸碱度、盐浓度等多种环境因子，以研究不同环境因子对微生物降解农药的降解效果的影响，探讨影响微生物农药降解效果的关键影响因子。
二、实验用品
1、菌株：上述实验所分离到的农药降解菌株
2、器材：紫外分光光度计、石英比色杯、接种环、移液器等
3、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、CSM基础培养基
4、试剂：农药、二氯甲烷
三、实验步骤
1、种子液的制备
在LB液体培养基中接种分离筛选的菌株，摇床150rpm振荡培养24h后，以备后续实验接种用。
2、不同因素对农药降解的影响（可任选其一）
① 温度：设置16、28、37℃ 3个温度；
② pH值：分别将培养基的初始pH值调整到5、7、9、11，分析pH对农药降解的影响；
③ 盐浓度：将培养基的初始盐浓度分别设置为0.1%，1%，2%，3%，5%
④ C源种类：分别将CSM基础培养基中的碳源设为葡萄糖，蔗糖，淀粉，分析不同种类的C源对农药降解的影响；
⑤ N源种类：分别在CSM基础培养基中添加硫酸铵，氯化铵，尿素为N源，分析不同种类的C源对降解的影响；
⑥ 农药初始浓度：在基础培养基中添加豆磺隆农药使其初始浓度分别为50，100，150，200 mg/L.
⑦ 接种量：将接种量分别设为5%、10%、15%、20%等。
注意以上各处理均应设置未接种的空白样品作为对照，如无特殊说明培养基中农药终浓度为100 mg/L，接种量为5%，培养温度为28-30℃。
将提前准备好的分离菌株种子培养液按接种量为5%接种到以上各培养基中，振荡培养5-7天后，取样测定各培养液中农药的残留量。以不接菌的相应空白培养基作为对照处理。
3、农药浓度测定
分别每隔一定时间段取样5ml，采用紫外分光光度法测定残留农药的含量。
Ⅰ、豆磺隆的测定
① 标准曲线的制备：
首先制作标准曲线：称取0.0040g豆磺隆标准品至100ml容量瓶中，以约1.5-2ml二氯甲烷助溶解并用水稀释定容，即得浓度为40μg/ml的母液。分别取40μg/ml的母液0，312，625，936，1250，1875，2500，5000µL，并依次补足水至总体积5ml，即得浓度分别为0，2.5，5，7.5，10，15，20μg/ml的豆磺隆系列稀释液。于235nm波长处测其吸光度，并以浓度(c)对吸光度(A)作标准曲线。
② 培养液各样品中的农药浓度测定。
吸取5ml培养液，8000rpm离心10min, 取出上清，调pH约7.0后，用紫外分光光度计于235nm处比色测定农药残余量。或离心后用等体积的二氯甲烷（5毫升）萃取培养液，取有机相液体4毫升用于测量菌株分解后豆磺隆残余量。
Ⅱ、氯氰菊酯的测定
① 标准曲线的制作：
以二氯甲烷为有机溶剂，分别配制一系列梯度浓度为20mg/L、40、60、80、100 mg/L的氯氰菊酯二氯甲烷溶液，用紫外分光光度法于278nm测定吸光度值，并以氯氰菊酯浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到氯氰菊酯浓度（ｃ）和吸光度值（Ａ）之间的线性回归方程。将待测样品测定的吸光度值带入上述线性回归方程，计算测定样品中的氯氰菊酯浓度，并计算降解率。
② 培养液各样品中的农药浓度测定。
吸取5ml培养液，8000rpm离心后，取上清3-4ml。以二氯甲烷作为萃取剂，将吸取的培养液上清加入等体积二氯甲烷的玻璃比色管中，涡旋振荡1min后，室温静置1h，分层后弃上清，保留下层有机相，因氯氰菊酯在278nm处有特征吸收峰，可用紫外分光光度法于278nm检测氯氰菊酯含量，并计算降解率。
降解率%=（1—接种样品农药残留量/未接种的空白样品农药量）×100%
降解率=(未接种的空白样品农药残留量—接种样品农药残留量)/ 未接种的空白样品农药残留量*100%
四、实验作业
计算所分离的细菌对特定农药的降解率并作图分析。