实验一  植物光合速率的测定

（一）实验目的

1．了解植物光合速率测定的原理，

2．掌握测定方法，学习实验数据统计与分析

（二）实验材料与用品

1．材料：玉米叶片，对照组和逆境处理组

2．试剂：无水氯化钙（无水硫酸钙），烧碱石棉（10目）或碱石灰

3．器材：LI-6400（LI-COR Inc.，美国）便携式光合作用测定系统。

（三）实验内容与方法

1. 选取籽粒饱满的玉米种子，浸泡发芽，

2. 试验设计：盆栽试验, 设三个处理、四个重复。

水平1（对照）: 土壤含水量控制在60%～80%之间, 达到玉米苗生长的最佳含水量范围；水平2（湿害）: 淹水水面至盆中土壤表面；

水平3（涝害）: 淹水水面距盆中土壤表面2～3cm左右。

每个处理4盆, 试验用盆采用塑料营养钵, 高度为30cm,侧边设置一个出水孔。

一次施足底肥后装土; 种子经催芽后播于钵中,幼苗长至3叶期, 每钵去除长势差的苗, 留4株生长健壮、长势一致的苗作试验用, 幼苗长至第4真叶完全展开时, 进行淹水处理, 持续5d, 每天上午、下午各浇水一次, 保持水位达到设计要求。

3. 测定：玉米苗接受水淹后每隔1d, 上午9∶00采用LI-6400（LI-COR Inc.，美国）便携式光合作用测定系统测定叶片净光合速率（Pn）、细胞间隙二氧化碳浓度（Ci）、气孔导度（Gs）

4. 测定结束，用叶面积仪测量叶片的面积。

5. 读取各处理组的相关数据 ，

（四）作业

1. 将对照组与处理组的实验数据进行统计分析，分析差异。

2．在光合速率的测定过程中，哪些步骤容易出现误差了应怎样避免 ?

3. 水淹后，玉米的光合速率出现了哪些变化，并解释原理。

实验二 红外CO₂分析仪法测定植物呼吸速率

（一）实验目的

1. 掌握红外CO₂分析仪法测定植物呼吸速率原理

（二）实验材料与用品

1. 玉米叶片正常组和逆境处理组。红外CO₂分析仪

2．试剂：无水氯化钙（无水硫酸钙），烧碱石棉（10目）或碱石灰

（三）实验内容和方法

1. 取实验1 的材料。

2. 按仪器使用说明书要求将气路系统的各部分连接起来，打开气室。接通电源，打开红外仪电源预热15min，表头显示的数据为残留在样品室中的CO₂的气体浓度值。预热过程中气泵开关应处在关闭的位置上。

3. 将仪器后面板的切换阀旋到左侧的调零位置上，打开气泵电源，约1min后，数显表头的显示值趋向零点附近，调节红外仪前面板“调零”旋钮，显示在“零点”位置。

4. 跨度校准：关上气泵的开关，将仪器后面板的切换阀旋到右侧的测量位置上，将室外气以1.2L/min的流量与仪器的“进气口”相连，使空气通入仪器内，约10-20min左右，待显示值稳定以后，读取CO₂初始浓度值C₁，再检测样品。

5. 测定开始前称量样品的重量。将待测植物果实或叶片放入呼吸室（气室），开始测定，CO₂浓度开始稳定上升，至CO₂上升稳定后，读取CO₂浓度值C₂，记录C₁、C₂、ΔC。

6.  计算呼吸速率：

上式中，Q_呼吸－呼吸速率（单位CO₂μmol·g^﹣1·h^﹣1）；ΔC－CO₂浓度落差C₂-C₁（ppm：uL/L）； W－样品重量（单位g）； t－呼吸室的温度；P－大气压（单位Mpa）；F代表气体流量。

7. 呼吸速率测定：叶室用遮光布（由红、白、黑布叠缝而成）遮光。

表1  植物呼吸速率测定记录表

植物材料	样品重量(g)	呼吸室温度t (℃)	大气压P (Mpa)	CO2浓度落差ΔC（ppm：uL/L）	重复测定平均值ΔC
果实等
呼吸速率 （CO2μmol·g﹣1·h﹣1）

（四）作业

1. 数据记录与分析

2. 分析逆境处理组与对照之间差异及原理

实验三  植物RUBP羧化酶活力的测定

（一）实验原理

在 RuBPCase 的催化下， 1 分子的核酮糖– 1，5 –二磷酸（RuBP） 与 1 分子的 CO₂结合，产生2分子的3–磷酸甘油酸（PGA），PGA可通过外加的3–磷酸甘油酸激酶和甘油醛–3–磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛–3–磷酸，并使 NADH 氧化，这里 1 分子CO₂被固定，就有 2 分子 NADH 被氧化。因此，由 NADH 氧化的量就可计算 RuBPCase 的活性，由 340 nm 吸光度的变化可计算 NADH 氧化的量。为了使 NADH 的氧化与CO₂的固定同步，从而需要加入磷酸肌酸（Cr～P）和磷酸肌酸激酶的 ATP 再生系统。

（二）实验材料与用品

1．材料： 实验1培育的玉米材料。

2．试剂：

(1) 5 mmol·L-1NADH；

(2) 25 mmol·L-1RuBP；

(3) 0.2 mol·L-1NaHCO₃；

(4) RuBPCase 提取介质：40 mmol·L-1 Tris – HCl ( pH 7.6)缓冲液，内含10 mmol·L^-1MgCl₂、0.25 mmol·L^-1EDTA、5 mmol·L^-1谷胱甘肽；

(5) 反应介质：100 mmol·L-1Tris–HCl缓冲液，内含12mmol·L-1MgCl₂和0.4mmol·L^-1

EDTA-Na₂，pH7.8；

(6) 160 U·ml-1磷酸肌酸激酶溶液；

(7) 160 U·ml-1甘油醛– 3 –磷酸脱氢酶溶液；

(8) 50 mmol·L^-1 ATP；

(9) 50 mmol·L^-1磷酸肌酸；

(10) 160 U·ml^-1磷酸甘油酸激酶溶液；

(11) 菠菜的 RuBPCase 提取液。

3．器材：紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器，移液管，秒表。

（三）实验内容与方法

1. 酶粗提液的制备：

取新鲜菠菜叶片 10 g ，洗净擦干，放匀浆器中，加入 10 ml预冷的提取介质，高速匀浆 30 s ，停30 s ，交替进行 3 次；匀浆经 4 层纱布过滤，滤液于20000 × g 4 ℃下离心 15 min ，弃沉淀；上清液即酶粗提液，置 0 ℃保存备用。

2. RuBPCase 活力测定： 按表2配制酶反应体系。

表2  各溶剂含量及配制

3．将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上 340 nm 处反应体系的吸光度作为零点值。将 0.1 ml RuBP 加于比色杯内，并马上计时，每隔 30 s 测一次吸光度，共测 3 min 。以零点到第一分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力。

由于酶提取液中可能存在 PGA ，会使酶活力测定产生误差，因此除上述测定外，还需做一个不加 RuBP 的对照。对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后马上测定此反应体系在 340 nm 处的吸光度，并记录前一分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。

4．结果计算

式中： ΔA ：反应最初 1min 内 340 nm 处吸光度变化的绝对值（减去对照液最初 1 分钟的变化量），N ：稀释倍数，6.22：每微摩尔 NADH 在 340 nm 处的吸光系数，2 ：表示每固定 1 molCO₂有 2 mol NADH 被氧化，Δt ：测定时间 1 min，d：比色皿光程，cm 。

（四）作业

1．分析对照组与逆境处理组玉米叶片RuBPCase活力的差异。

2．RuBP很不稳定，特别在碱性环境下，因而应在pH 5.0～6.5 之间于-20℃保存，最好现配现用。

3. RuBPCase 在光合作用中的生物学意义 ?

4. 为什么加入ATP 再生系统就可使NADH氧化与CO₂的固定同步?

实验四  植物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶活力的测定

（一）实验原理

PEP羧化酶是C4植物和CAM植物固定CO₂的关键酶。在Mg²⁺存在下，PEP羧化酶可催化PEP与HCO3-形成草酰乙酸（OAA），后者在苹果酸脱氢酶（MDH）催化下，可被NADH还原为苹果酸（Mal）。通过在340 nm 处测定反应体系吸光度的变化，计算出NADH 的消耗速率进一步推算出PEP羧化酶的活性。

（二）、实验材料与用品

1.材料：玉米、高梁等C4植物的叶片。

2.器材：紫外分光光度计，冷冻离心机，组织捣碎机，Sephadex G-25柱（2 cm×45 cm）,DEAE

（二乙胺基乙基）-纤维素（DE-52，1 cm×30 cm）柱，紫外监测仪，部分收集器，蠕动泵。

3.试剂：提取缓冲液：0.1 mol·L-1 Tris-H₂SO₄ 缓冲液(pH 7.4)，内含7 mmol·L-1 硫基乙醇,1mmol·L-1 EDTA,5％ 甘油。

平衡缓冲液：10 mol·L^-1 Tris-H₂SO₄缓冲液(pH 8.2)，内含0.2 mmol·L-1 EDTA，0.2 mol·L^-1

DTT(二硫苏木糖醇)，5％ 甘油。

反应缓冲液：0.1 mol·L^-1 Tris-H₂SO₄缓冲液(pH 9.2)，内含0.1 mol·L^-1 MgCl₂。

反应试剂：100 mmol·L^-1 NaHCO₃，40 mmol·L^-1 PEP，1 mg·mL^-1 NADH(pH 8.9)，苹果酸脱氢酶（MDH）。

（三）实验内容与方法

1. 粗酶液提取

将叶片洗净并吸去水分，去掉中脉，称取20 g ,放入冰箱中过夜，次日剪碎放入组织捣碎机中，加入提取缓冲液（已预冷）80 mL，20 000r/min 匀浆2 min（运行30 s、间歇10 s，反复匀浆），用4层纱布过滤，取滤液于高速冷冻离心机上15 000g 离心10 min，上清液即为PEP 羧化酶的粗酶提取液。以上过程均在0～4℃下进行。

2. 酶的纯化

A. 硫酸铵分步沉淀：将上述粗酶液装入烧杯，于搅拌器上搅拌，缓慢加入固体硫酸铵

粉末达到35％ 饱和度，在冰箱中静置1 h，于15 000g 下离心10 min；取上清液再缓慢加

入固体硫酸铵粉末达到55％ 饱和度，冰箱静置1 h，再于15 000g下离心10 min，弃上清

液，沉淀用平衡缓冲液8 mL 复溶。

B. Sephadex G-25 柱层析：先用平衡缓冲液平衡Sephadex G-25 柱（2 cm×45 cm）。

将上述复溶溶液上柱，压样2 次，用平衡缓冲液洗脱，洗脱速度为50 mL·h^-1，通过检测仪，

收集有酶活性的部分，于15 000g 下离心10 min，上清液即为PEP 羧化酶的部分纯化酶液。

C. DEAE-纤维素柱层析：把转型的DEAE-52 装入1 cm×30 cm 的层析柱，用平衡缓冲液

平衡2 h，将上述已部分纯化的酶液上DEAE-52柱，压样2 次，用平衡缓冲液洗脱，通过紫外检测仪，用部分收集器收集。用平衡缓冲液配制0.0～0.6 mol·L^-1 NaCl溶液进行连续性梯度洗脱（速度为30 mL·h-1），收集有酶活性的部分即为纯化的PEP 羧化酶，用于酶活性的测定。

3. 酶活性测定

取试管1 支，依次加入1.0 mL 反应缓冲液，0.1 mL 40 mmol·L^-1 PEP，0.1 mL 1 mg·mL^-1

NADH （pH 8.9），0.1 mL 苹果酸脱氢酶和0.1 mL PEP 羧化酶(已纯化的提取液)，1.5 mL

蒸馏水，在所测温度（如30℃）下恒温水浴保温10 min，在340 nm 下测定吸光度值A340（A0）；然后加入0.1 mL 100 mmol·L^-1 NaHCO₃启动反应，立即记时，每隔30 s测定一次吸光度值（A1），记录其变化。

4. 实验数据记录与计算

式中：A =A0-A1 ；v——测定混合液总体积（3 mL）；

L——比色杯光程（cm）；

0.1——反应混合液中酶液用量（mL）；

m——酶液稀释倍数；

a ——NADH 于340 nm处的摩尔消光系数（6.22×103 mol^-1·cm^-1）。

（四）作业

1. 分析玉米叶片对照组与逆境处理组PEP 羧化酶活性差异及其原理

2. 测定时的酶液用量需事先试验，苹果酸脱氢酶的用量视丙酮酸羧化酶活性大小而定，也

可事先通过实验确定最佳用量。

3. 哪些因素可能影响该实验的测定结果？

4. 分析对照组与处理组之间PEP羧化酶活力的差异，并分析原因。

实验五  植物叶绿素荧光产量的测定

（一）实验目的

1．学习叶绿素荧光仪测定原理和操作方法，

2．掌握叶绿素荧光应用

（二）实验材料与用品

1．材料：植物叶片。

2．器材：PAM2100荧光仪

（三）实验内容与方法

1．实验材料：玉米对照组和逆境处理组

2. PAM荧光仪的使用

打开“基础模式”后可以看到显示屏上分为五列，列出了很多参数。第1列是测量的荧光数据，第2～5列是四种光源（测量光，L；光化光，A；饱和脉冲，S；远红光，F）。在样品室中加入样品后，打开测量光（L键），Ft栏就会有不断变化的数据显示，这就是实时测得的荧光值。

3．叶片与荧光标准的比较

如果样品是叶片，打开光化光后（A键），Ft迅速上升，到达峰值后缓慢下降，这就是Kautsky效应。如果样品是荧光标准，打开光化光后，Ft无变化（说明无光合作用）。

4．光化学光强度对叶绿素荧光的影响

将玉米不同处理叶片放入样品室，把光化学强度（“Int”）设为3（按2键选定，通过“+”“-”调节）。打开光化光，等Ft值稳定后，按“+”键逐渐增大光化光强度。可以发现“Int”每增加1，

Ft总是先上升后下降。这反映了光合器官对光环境改变后的适应能力。

5．远红光的作用

在较弱的光化光下（“Int”=1），叶片Ft达到稳定状态后，打开远红光（F键）。可以看到，与短波红色光化光的作用不同，远红光只会使荧光产量下降。说明远红光可以通过启动光系统Ⅰ的活性来氧化光系统Ⅱ的受体制，从而增加了光系统Ⅱ的量子产量。

6．饱和脉冲的作用

按“S”键可以打开持续时间为1秒的饱和脉冲光，当“Int”为10时相当于PAR强度3500µmol·m-2·s-1。饱和脉冲的作用效果取决于样品状态。叶片经暗适应后，打开饱和脉冲，Ft迅速上升到最大值（Fm），随后荧光缓慢地衰减（远红光可以加速此衰减过程）。若叶片在光适应（如光化光“Int”为3时照射几分钟）下，则饱和脉冲诱导的Ft峰值（Fm’）要明显低于暗适应下（Fm），而且荧光很快就衰减到初始值。打开饱和脉冲后的最大Ft值显示在Fm’区。暗适应的叶片打开饱和脉冲后Ft会增加约5倍。一般来讲，光化光越强，Fm’越低。每打开一个饱和脉冲，Yield区都会显示一个数值。Yield=（Fm’-Ft）/ Fm’，代表了光系统Ⅱ的量子产量。

7．结果与分析

1）光化光强度对叶绿素荧光的影响：

Int=1      Ft=80

Int=2      Ft=340

Int=3      Ft=374

Int=4      Ft=400

随着光化光强度的增加，Ft值升高，这是由于电子在两个光系统之间的累积；随着光化光强度的逐步增强，Ft先快速上升，随后增长速率减小；远红光照射后，Ft下降，随后变为0。

2）PAM荧光仪测量的是荧光产量，在死样品中荧光产量相当恒定，而在活样品中，荧光产量的变化范围可以达到5倍。

3）在活样品中，荧光发射的概率（荧光产量）与其它两种去激发途径（光化学和热耗散）密切相关。因此，不仅光和能量转换可以降低荧光产量，热耗散也可以降低荧光产量。

4）实验表明活体叶绿素荧光主要来源于光系统Ⅱ（而不是光系统Ⅰ）。照射红光（光化光）可以引起Ft上升，这是因为在两个光系统之间的累积。当照射远红光时，可以促进PSⅠ活性，PSⅡ受体侧被氧化，Ft降低。故PSⅠ的活性也可以通过荧光来间接测定。

5）光适应可以导致光合器官发生显著的变化，这可以明显促进光合活性（电子从光系统Ⅱ向后传递的速率增加）。

（四）作业

1．什么叫荧光现象？荧光有何特点？

2．研究叶绿素荧光产量变化有何意义？

3.  对照组与逆境处理组玉米叶片荧光产量的比较。