环境生态学实验
实验方案
实验一 重金属污染对植物种子萌发及幼苗生长的影响
（一）实验原理
重金属污染影响植物生长发育和代谢的主要是铜、铬、铅、镉、锌、钴和汞等。铜为人体必需元素，但摄取过多却干扰人体正常的新陈代谢，甚至造成中毒。重金属还能通过抑制作物细胞分裂和伸长、刺激和抑制一些酶的活性，影响组织蛋白质合成，降低光合作用和呼吸作用，伤害细胞膜系统，从而影响作物的生长和发育。因此种子发芽和幼苗生长是检测土壤等环境污染的重要指标。
（二）实验材料及器材
1. 仪器与设备：试管；培养皿；千分尺；恒温光照培养箱分光光度计；离心机；离心管；恒温水浴；研钵；具塞刻度试管；容量瓶；洗耳球；移液管；脱脂棉；漏斗；滤纸；滴定管
2．试剂：蒸馏水；次氯酸钠、硝酸铅、硫酸铜、硫酸锌
3. 材料：萝卜、小麦种子
（三）实验步骤
1. 重金属污染土壤的准备
菜园土风干后，过20目筛，分别加入不同含量的硫酸铜溶液，使土壤中铜浓度分别为0，5，10，20，50，100mg/kg,充分混合搅拌均匀后，装盆放置备用。
2. 种子消毒与萌发
选取籽粒饱满的植物种子, 种子用乙醇：30% H2O2 （V：V=1：1）表面消毒后，置于不同浓度梯度的重金属污染土壤中，25℃恒温催芽培养。
3. 测定植物幼苗的根长和苗长
每天定时浇水，待发芽后继续生长30-40天后，小心将幼苗从土中取出，用直尺分别测定幼苗的根长和苗长。
（四）作业
撰写实验报告，分析不同重金属浓度对种子萌发率、根长、苗长的影响
实验二 植物抗逆性的测定（电导仪法）
（一）实验原理
在正常生长状况下，植物细胞膜保持着良好的选择透性，而当植物组织受到逆境（例如重金属、干旱、低温、高温、盐渍等）伤害时，由于膜脂过氧化、膜蛋白变性及膜脂流动性改变，造成膜相变和膜结构破坏，使得细胞膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，胁迫强度越大，伤害越重，外渗越多，电导率的增加也越大。同时也与植物抗逆性的强弱有关，抗性越强，伤害越轻，外渗越少，电导率的增加也越小。所以，通过测定外渗液电导率的变化，就可以反映出细胞膜的伤害程度和所测材料抗逆性的大小。
（二）实验材料与用品
电导仪、电子天平，真空干燥器、摇床、打孔器、电炉、镊子、白布，玻璃缸、50ml烧杯，量筒、玻棒。
（三）实验内容与方法
1．容器的洗涤
电导法对水和容器的洁净度要求严格，所用容器必须彻底清洗，再用去离子水冲净，倒臵于洁净滤纸上备用。
2. 测定不同处理的植物叶片电导率
(1) 将处理组叶片与对照组叶片用去离子水冲洗2次，再用洁净滤纸吸净表面水分，各称取2g，然后剪成长约1cm小段放入小烧杯中（大小以够容电极为度），并用玻璃棒压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。 将其放入真空干燥器中，用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空气；重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶片下沉。（注：材料为阔叶时，最好使用打孔器取材）
(2) 将抽过气的小烧杯取出，放在实验桌上静置20min，然后用玻棒轻轻搅动叶片，在20～25℃恒温下，用电导仪分别测定处理组和对照组得电导值为T1和C1。
3. 根据所测不同浓度电导率，说明铜离子对其细胞膜透性的损伤程度。
（四）作业
撰写实验报告，分析细胞膜透性的损伤程度与铜离子浓度的关系。
（五）思考
测定电导率时为何反复清洗仪器和样品?
实验三 重金属污染对植物生理特性的影响
（一）实验原理
重金属胁迫将导致植物体内活性氧自由基水平急剧增加，并且打破其清除机制的动态平衡，对植物造成过氧化伤害。植物体内清除活性氧的酶促系统主要包括超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）。重金属胁迫下，抗氧化系统清除活性氧能力的高低直接与植物对重金属的耐性强弱有关。
（二）实验材料与用品
电子天平、超声波细胞粉碎机、台式高速冷冻离心、分光光度计、制冰机、试管、试管架、滤纸、恒温水浴锅、移液器、洗耳球、称量纸
（三）实验内容与方法
1．材料处理
分别取不同铜处理土壤中生长的植物新鲜叶片，用电子天平准确称量0.20 g叶片放入研钵中。
2．酶液提取
加2 mL预冷的pH 7.0的0.05 M磷酸缓冲液冰浴研磨成匀浆，将匀浆液转入离心管中，10000 rpm离心5 min，取上清液作为粗酶液。
3．显色反应
在透明的指形管中依次加入：PBS （pH7.8，0.05 M） 1.75 mL，130 mM甲硫氨酸 0.3 mL，750 µM NBT 0.3 mL，100 µM EDTA-2Na 0.3 mL，20 µM核黄素 0.3 mL，样品液50 µL，并混匀。将指形管置于4根日光灯下均匀直照5 min，立即测定A560nm。以PBS缓冲液代替样品液且不照光管为空白调零，以PBS缓冲液代替样品液照光管为最大光还原对照管（ACK）。
可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法。取200 µL样品液，加入800 µL 蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝G-250染液，混匀，5 min后测定595 nm下吸光值。以0-100 µg.mL-1的牛血清白蛋白1 mL，加5 mL染液反应5 min后的吸光值A595nm绘制标准曲线。
4．结果计算
上式中ACK为照光对照管的吸光值；AE为样品管的吸光值；V为样品液总体积，mL；V1为测定时样品用量，mL；W为样品鲜重，g；蛋白质含量单位为mg.g-1。SOD总活性以U.g-1FW表示；SOD比活力以U.mg-1protein。
（四）作业
撰写实验报告，分析植物体内超氧化物歧化酶的活性与铜浓度的关系。
实验四 水生植物对富营养化水体净化能力的比较
（一）实验原理
大量含氮、磷肥料的生产和使用，食品加工、畜产品加工等造成的工业废水和大量城市生活废水，特别是含磷洗涤剂产生的污水未经处理即行排放，使海水、湖水中富含氮、磷等植物营养物质，称为水体富营养化。由于有了充足的养料保证，藻类等浮游植物一有适宜条件即疯狂繁殖，导致水体缺氧 从而鱼类等动物大量死亡。富营养化是水体有机污染的一种表现，严重的富营养化可造成水生生态结构的破坏，加快湖泊等水体的老化过程。
某些水生植物能有效去除有机物、氮磷等多种元素，对水中氮、磷具有较强的吸收富集能力, 可增加水体中的氧气含量，能较好地减轻和控制水体富营养化, 所以恢复富营养湖泊水生植被是合理有效的水质净化和湖泊生态系统恢复的重要措施之一。不同的水生植物对水体中的氮磷营养物质的吸收富集能力是不同的，在初始相同的生长水体环境下，通过比较水体中剩余氮磷的含量，可以明确各种水生植物对富营养化水体的净化能力。实验中水体中总磷和总氮的测定分别采用钼酸铵分光光度法和碱性消解紫外分光光度法。
（二）实验材料与用品
全自动定氮仪、50ml比色管、离心机、紫外分光光度计、分析天平、酸式滴定管、试管架、玻璃缸、移液管、洗耳球、称量纸
（三）实验内容与方法
1、试验处理
取5种生长正常的水生植物（荷花、睡莲、水葱、千屈菜、凤眼莲）各10盆，将获取的水生植物分别移栽入盛有清水和底泥的直径60cm的水缸中，在室外自然光照条件下，预培养20天，使这5种水生植物均处于相同的生长环境并恢复至正常生长状态。开始处理后，倒掉全部清水，缸内加入一定体积试验用水，每隔2-3天用蒸馏水补充蒸发水分，以保持体积不变。每隔5天，取缸中部水样进行测定。
2、总磷的测定：钼酸铵分光光度法（GB 11893－89）
绘制磷标准曲线：在分析天平上称取经105℃烘至恒重的磷酸二氢钾1.0985g，加约200mL水溶解，加5mL浓硫酸（防腐），最后用水定容到1L，此溶液为浓度250mg·L-1的磷母液，可长期保存。将一定量磷母液稀释10倍得浓度为25mg·L-1的磷标准工作液。分别吸取上述磷标准工作溶液0、l00、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 µL于比色管中，加水稀释至约4 mL，滴入2滴2，4-二硝基酚作为显色剂，再滴入几滴4N NaOH使溶液调至刚出现黄色，接着用2N H2SO4调至无色。加1L钼锑抗显色试剂（含抗坏血酸），并补水至10mL定容，摇匀后静置反应30min, 于分光光度计700nm处测定吸光值.。以测得的吸光度为纵坐标，磷浓度(μg·mL-1)为横坐标，绘制成磷标准曲线。
取水样100 µL，加入4 mL三级水，滴入2滴2，4-二硝基酚作为显色剂，再滴入几滴4N NaOH使溶液调至刚出现黄色，接着用2N H2SO4调至无色。加1L钼锑抗显色试剂（含抗坏血酸），并补水至10mL定容，摇匀后静置反应30min, 于分光光度计700nm处测定吸光值。通过磷标准曲线，可查出各处理水样中可溶性磷的浓度。
3、总氮的测定：碱性消解紫外分光光度法
标准曲线的测定：分别吸取(10 mgN/L)硝酸钾标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00和7.00 mL于25 mL具塞磨口玻璃比色管中，其对应的总氮（以N计）含量分别为0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、2.00和2.80mg/L。加无氨水定容，直接上机测定，用差值△A与浓度c作标准曲线。计算线性回归方程。
样品测定：（1）取10.00 mL试样（20～80μgN）置于比色管中＋5 mL碱性过硫酸钾溶液，塞紧磨口塞用绳扎紧瓶塞，以防弹出→将比色管置于医用手提蒸气灭菌器中，加热至顶压阀吹气，关阀→使压力表指针到1.1～1.3 kg/cm2，此时温度达120～124 ℃后开始计时→保持温度在120～124 ℃之间30 min→自然冷却、开阀放气，移去外盖，取出比色管，冷却至室温，按住管塞将比色管中的液体颠倒混匀2～3次→＋(1＋9)盐酸1.0 mL→用无氨水稀释至25 mL标线，盖塞混匀→在紫外分光光度计上，以无氨水作参比，10 mm石英比色皿，分别在波长为220 nm与275 nm处测定吸光度，并用式（1-1）计算出校正吸光度Ar。同时作空白（10 mL无氨水代替试样，Ab≤0.03）
4、结果计算
A＝A220－2A275 （1-1）
按式(1-1)计算样品的校正吸光度Ar，减去Ab后在标准曲线上查出相应的总氮浓度，乘以定容体积，得总氮质量m，按下式计算总氮浓度CN。
式中：CN(mg/L)；m —试样含氮量，mg； V —试样体积，L。
（四）作业
撰写实验报告，分析不同水生植物与水体污染状况的关系。
实验五 植物对土壤重金属富集作用研究
（一）实验目的
1. 掌握植物的消解方法。
2. 熟练掌握电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-AES）或原子吸收分光光度计的操作。
3. 通过实验，研究植物叶片富集重金属的能力。
（二）实验材料
1. 仪器与设备：电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-AES）、电子天平、电炉、马弗炉、50ml容量瓶、粉碎机、烘箱、瓷坩埚。
2. 材料与试剂：萝卜或小麦种子、硝酸铅、硝酸（分析纯）、硫酸、高氯酸。
（三）实验步骤及方法
1. 植物种植
2. 消解前准备
从盆中小心取出植物，用去离子水充分洗净。沿根茎结合处分离根部与地上部，并将各部分样品分别置于烘箱中105℃烘干。将植物干样磨碎，备用。
清洗干净的消煮管用10% 的HNO3浸泡24 h，清水冲洗后并用去离子水润洗3次，烘干备用。
3. 样品的消解
准确称取一定量样品于消煮管中（地上部0.200 g，根部0.100 g），用HClO4:HNO3（优级纯，V:V = 13:87）的混合酸液于140℃消煮，消煮后的样品加5% HNO3于80℃温浴溶解1 h，冷却后定容至10 mL。
4.重金属的测定
用ICP测定溶液中的Cu含量，并计算出植物叶片中的重金属含量。
（四）作业
撰写实验报告，分析不同生植物及同一植物体不同器官对不同重金属吸收、分布与富集的关系。