实验一 玉米根际细菌的分离与纯化

一、 实验原理

植物根际是指在植物根系周围，受根系活动影响所及的土体区域，一般指离根系几毫米（约2mm）范围内的区域。植物根际含有丰富的营养物质—根系分泌物，大量微生物能够定殖于此，这构成了根际特有的微生物区系。在自然条件下，微生物常常成群落存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性，或者要大量培养和使用一种微生物，必须从这些混杂的微生物群中获得纯培养。纯培养就是指从自然界或已混有杂菌的培养体中分离出生产或科学实验所需要的单一的微生物个体，进行培养，产生大量的后代。获得纯培养的方法，称为微生物的纯系分离法或微生物的分离和纯化。 获得微生物纯培养的方法很多，常用的有稀释平板分离法、划线分离纯化法等。

二、实验用品

1．实验样品

分别于不同地点采集的玉米植物根际土壤样品。

2. 器材

灭菌培养皿（9cm），灭菌三角烧瓶（250 mL），灭菌枪头（蓝、黄），高压灭菌锅，PH试纸，无菌水，无菌过滤器及滤膜，接种环，涂布棒、量筒、移液器（1ml, 100µl, 5ml）等。

3. 培养基

NBRIP 培养基

三、实验步骤

1、土壤稀释液的制备

称取1克根际土或附着一定土的植物根，放入到100ml无菌水中，摇床中150rpm振荡约10min左右，以使土壤中的微生物细胞均匀分散于水中，即得到10^-2的土壤悬液。取1ml上述土壤悬液加入到9ml无菌水中，轻轻摇动使之充分混合均匀，即得10^-3土壤悬液。同法依次进行10倍梯度的系列稀释，则分别得10^-4、10^-5……的土壤稀释液。

2、稀释涂布平板

分别吸取0.1ml 10^-2-10^-5的土壤稀释液加入NBRIP平板表面，用无菌涂布棒涂布均匀，做好标记，28℃倒置培养72h。

3、平板划线分纯：

对NBRIP分离平板上产溶磷圈或生长势较好的单菌落进行菌株编号，用接种环分别无菌操作挑取这些菌落于新的NBRIP固体平板上采用三分区或四分区划线法进行划线分纯。

做好菌株编号、样品来源、时间、组名等标记，将划线的平板于28℃恒温培养箱倒置培养72h。

四、注意事项

为了做好微生物的分离、纯化，在实验的每一个操作环节上都要严格无菌操作，才能获得预期效果。

稀释涂布平板时，在向平板中加入稀释土壤悬液时按照稀释倍数高（10-5）的样品向稀释倍数低的样品依次进行，涂布时也是如此。

划线分纯微生物时，非连续划线操作过程中，要将接种环上的剩余残留菌物烧死，待冷却后再作第2次划线，这样才能保证获得单菌落。

实验二 分离菌株的促生特性

一、实验原理

能够自由生活在植物根际土壤的一类以直接或间接方式促进植物生长的有益细菌被称为植物根际促生细菌（plant growth- promoting rhizobaeteria，简称PGPR)。PGPR能够通过多种途径促进植物生长，主要包括：①产生植物生长激素等物质；②促进植物对营养元素的吸收利用；③提高植物抑制病虫害等的生防能力；④减少胁迫环境下乙烯的累积。一些微生物能够通过代谢产酸，使难溶性磷酸盐转变为可溶性磷酸盐，从而能在以难溶性磷酸盐（磷酸钙）为唯一磷源的平板上生长形成透明的溶磷圈，这类微生物被称为解磷微生物，他们在土壤中能促使土壤中难溶性磷素转化为易于被植物吸收的可溶性磷，从而增加植物对磷素营养的需求；还有些微生物能够分泌ACC脱氨酶，以分解体内乙烯合成的前体—ACC(1-氨基环丙烷羧酸)，减少乙烯的产生，延迟植物的衰老，促进植物生长。而这些能够分泌ACC脱氨酶的细菌能够在以ACC为唯一氮源的培养基中良好生长。还有些微生物能够通过解钾，固氮，产生铁载体、吲哚乙酸、抗生素等方式，直接或者间接地促进植物生长。对植物根际或土壤中具促生特性菌株的分离筛选将有利于丰富微生物肥料生产所需的优良菌种资源。

二、实验用品

1．供试菌株

实验一中分离纯化获得的菌株。

2．器材：分光光度计、接种针、接种环、比色杯、培养皿、三角瓶、高压灭菌锅、直尺、量筒

3．培养基

⑴ DF培养基

⑵ ADF培养基

⑶ NDF培养基：在DF培养基中加入(NH₄)₂SO₄作为唯一氮源，使(NH₄)₂SO₄终浓度为0.2%。

⑷ NBRIP 培养基（解磷培养基）

⑸ NBRIP-P培养基

将Ca₃(PO₄)₂改为磷酸二氢钠 1克

4．试剂

2，4-二硝基酚、4N NaOH、浓硫酸、2N H₂SO₄、钼锑抗显色试剂、抗坏血酸、ACC

三、实验步骤

1、配制培养基

配制NBRIP-P培养液（活化接种用）及NBRIP 培养基。

溶磷培养液分装至小试管中(d=1.5 cm)，115℃灭菌25 min，冷却备用。

2、溶磷圈大小测定

将纯化的菌株采用点接法接种到NBRIP固体平板上，每一菌株做三个重复，28℃倒置培养72小时后，分别测量并记录溶磷圈及菌落直径大小，并计算菌株的溶磷效率。

P-solubilization efficiency = 溶磷圈直径/ 菌落生长直径

3、菌株液体溶磷能力的测定

⑴ 种子液的制备：将待测菌株依次接种至NBRIP-P培养液中，28℃，160 r•min^-1培养1-2d，以获得对数生长期的菌液，以备后续接种用。

⑵ 培养及测定：将活化好的菌株依次接种至NBRIP培养液中，28℃，160 r•min^-1培养5-7 d。取4 mL菌液，8000 r•min^-1离心10 min，取上清液100 µL，加入4 mL三级水，滴入2滴2，4-二硝基酚作为显色剂，再滴入几滴4N NaOH使溶液调至刚出现黄色，接着用2N H₂SO₄调至无色。加1mL钼锑抗显色试剂（含抗坏血酸），并补水至10mL定容，摇匀后静置反应30min, 于分光光度计700nm处测定吸光值。同时以未接种的空白培养基作相应处理的作为对照。通过磷标准曲线，可查出接菌处理各培养液中可溶性磷的浓度。

⑶ 培养液pH值测定

用pH计检测并记录培养液pH值，以研究菌株溶磷能力与菌株产酸能力间的相关关系。

⑷ 磷标准曲线的绘制

在分析天平上称取经105℃烘至恒重的磷酸二氢钾1.0985g，加约200mL水溶解，加5mL浓硫酸（防腐），最后用水定容到1L，此溶液为浓度250mg•L^-1的磷母液，可长期保存。将一定量磷母液稀释10倍得浓度为25mg•L^-1的磷标准工作液。分别吸取上述磷标准工作溶液0、l00、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 µL于比色管中，加水稀释至约4 mL，滴入2滴2，4-二硝基酚作为显色剂，再滴入几滴4N NaOH使溶液调至刚出现黄色，接着用2N H₂SO₄调至无色。加1mL钼锑抗显色试剂（含抗坏血酸），并补水至10mL定容，摇匀后静置反应30min, 于分光光度计700nm处测定吸光值.。以测得的吸光度为纵坐标，磷浓度(μg•mL^-1)为横坐标，绘制成磷标准曲线。

4、ACC脱氨酶特性

将纯化的菌株同时接种于含3ml DF、ADF、NDF液体培养基中摇床150rpm振荡培养72h后，观察同一菌株分别于DF、ADF、NDF三种不同培养基中的生长情况，并用分光光度计于OD600nm测定菌株长势。当菌株于ADF培养基中的生长势明显好于DF培养基时，说明该菌株能够以ACC为唯一氮源进行生长，即该菌株能够产生ACC脱氨酶。

四、注意事项

钼锑抗显色试剂要现配现用。

ACC溶液需过滤除菌。

实验三 分离菌株的生理生化特性

一、实验原理

微生物个体微小，形态简单。微生物分类鉴定的方法有很多种，通常可把微生物的分类鉴定方法分成4个不同水平：① 细胞的形态和习性水平，② 细胞组分水平 ，③ 蛋白质水平，④ 核酸水平。但传统的以实用为目的的表型特征，尤其是生理生化特征一直是细菌分类鉴定中经典且不可或缺的主要步骤与特征。不同的微生物具有不同的酶系统，其新陈代谢类型就不同。细菌代谢类型的多样性，具体表现在生化反应多样性，因此在细菌分类鉴定中，常利用其生理生化反应作为重要依据。人们可以用生物化学反应的方法来测定不同微生物对营养物质的利用，以及其代谢产物的异同。这些异同可以作为分类鉴定的依据之一。通常采用的生化实验有V.P实验；吲哚实验；明胶液化实验；淀粉水解实验等。

某些细菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸又可缩合、脱酸转变成乙酰甲基甲醇，如加入强碱液，即与空气中的氧起作用，产生二乙酰。二乙酰与蛋白质中的含胍基成分作用生成红色化合物，称为V.P阳性反应。无红色化合物产生的称为V.P阴性反应；有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚本身无颜色，但加入对二甲基氨基苯甲醛，与吲哚发生化学反应，就可以形成红色的玫瑰吲哚；明胶是一种动物蛋白，可由细菌蛋白酶（胞外酶）的水解作用，使其分子变小，从而导致明胶由原来的固态变为液态，即为明胶液化（即使在20℃以下也不凝固）。可用细菌能否液化明胶来判断其有无分解蛋白质的能力。常用的有穿刺法和平板法；有些细菌具有产生淀粉酶（胞外酶）的能力，可以把培养基中的淀粉水解为麦芽糖、葡萄糖等，再被细胞吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝。依此可以判断某细菌有无分解淀粉的能力。

二、实验用品

1．供试菌株

实验一中分离纯化获得的菌株。

2. 器材：接种针、接种环、培养皿、三角瓶、高压灭菌锅、直尺、量筒、显微镜，酒精灯，载玻片，吸水纸，擦镜纸等。

3．培养基

⑴ 明胶培养基：蛋白胨 5克, 明胶150克，水1L, pH 7.2。

⑵ 淀粉水解培养基：牛肉膏 3克，蛋白胨 5克，淀粉2克，水1L, pH7.2。

⑶ 葡萄糖蛋白胨水液体培养基（V.P实验或甲基红（M.R）实验）：蛋白胨5克，葡萄糖5克，NaCl 5克，水1L, pH7.2。

⑷ 1%胰胨培养基（吲哚实验）：胰蛋白胨 10克，水1 L, pH7.2。

⑸ 休和利夫森二氏半固体培养基

4. 试剂及配制：

结晶紫染色液，Lugol氏碘液，番红染色液，香柏油，二甲苯，凡士林石蜡油，3%过氧化氢

对二甲基氨基苯甲醛、95%乙醇、浓HCl、40%NaOH、碘液、6%α^_萘酚纯酒精液、广泛pH试纸，甲基红、乙醚。

吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛 8克、95%乙醇 760ml、浓HCl 160 ml。

甲基红试剂：甲基红 0.02克，95%乙醇 60ml, 蒸馏水 40ml。

V.P试剂：甲液：40% NaOH（40克NaOH溶解于100ml水中，置于小瓶中保存备用）。

乙液：6%α^_萘酚纯酒精液，（称取6克α^_萘酚溶解于100ml无水乙醇中）

三、实验步骤

3.1革兰氏染色

1．制片：在一张载玻片上，涂布待检测菌株制成涂片后，干燥、固定。为保证染色结果的准确性，可同时在同一载玻片上，分别涂布枯草杆菌和大肠杆菌作为标准对照组制成涂片后，干燥、固定。

2．染色：待玻片冷却后按下列步骤进行染色：

初染： 结晶紫染色1分钟 → 水洗

媒染：碘液1分钟 → 水洗

脱色： 95％酒精脱色30~40秒钟 → 水洗

复染： 番红染色2~3分钟或石炭酸复红染色30秒~1分钟 → 水洗 → 干燥。

3．镜检：在油镜下观察，被染成紫色者即为革兰氏阳性（G+ ）；被染成红色者是革兰氏染色阴性G- ）。

3.2 葡萄糖氧化发酵实验

用接种针无菌操作沾取少量菌苔，穿刺接种于休和利夫森二氏半固体培养基，每株菌株接种4支。其中2支用灭菌的凡士林石蜡油（熔化的2/3凡士林中加入1/3液体石蜡,高压灭菌）封盖，约0.5-1cm厚，以隔绝空气为闭管（注意：培养基内部中不要混有空气，否则会干扰观察发酵产酸的结果）。另2支不封油为开管。同时还要有不接种的闭管和开管作为对照。适温（28℃-37℃）培养3-14天后观察结果。只有开管产酸变黄者为氧化型；开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。

3.3 V.P试验

（1）接种 取葡萄糖蛋白胨水培养基二支，用接种环无菌操作，接种分离菌株，并注明菌株编号、日期、实验者，放恒温培养箱培养2d。

（2）检查 二天后取出，取培养液1ml，加入几滴V.P_甲液试剂，再加约等量的V.P试剂乙液，用力震荡，15分钟后观察实验结果。出现红色为V.P试验阳性。记录实验结果。

3.4 吲哚试验

（1）接种 取1%胰胨培养基二支，无菌操作，接种分离菌株，并注明菌株编号、日期、实验者，放恒温培养箱培养。

（2）检查 二天后取出，在培养液中先加入乙醚1ml（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚浮到上面。这时再沿管壁加入吲哚试剂5滴，有红色环出现者为阳性。注意：加入吲哚后不再摇动，否则液体界面被混合，红色环不明显。记录试验结果。

3.5 明胶液化试验

（1）接种 取培养18-24h的幼龄菌株穿刺接种于明胶液化培养基中，以不接种做对照，放20℃恒温箱培养。

（2）检查 二天后取出，观察菌株的生长情况及培养基是否液化、液化形状等。

3.6 淀粉水解试验

（1）接种 取融化了的淀粉培养基，无菌操作倒平板，等冷凝后，用接种环无菌操作，挑取少许分离菌株点接于平板中，并于平皿底上注明菌株编号、实验日期、实验人员等信息，37℃恒温箱倒置培养2-3天。

（2）观察结果 打开平皿盖，滴加碘液，轻轻摇转平皿，使碘液均匀铺满整个平皿，如果在菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉水解阳性，即淀粉被水解。透明圈大小表明菌对淀粉水解能力的大小。

3.7 甲基红实验

（1）接种 取葡萄糖蛋白胨水培养基二支，用接种环无菌操作，接种分离菌株，并注明菌株编号、日期、实验者，放恒温培养箱培养。

（2）检查 二天后取出培养液，沿管壁加入甲基红试剂1-2滴，若由原来的橘黄色变为红色则为阳性反应。记录实验结果。

3.8 接触酶实验

将培养24h的分离物，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡则为阴性。

四、注意事项

1. 吲哚试验中加入吲哚试剂后不再摇动，否则液体界面被混合，红色环不明显。

2．淀粉水解试验中透明圈大小表明菌对淀粉水解能力的大小。

3. 如有的菌在20℃不生长，则在30℃培养生长后，观察结果时将培养物放入冰箱或冷水中降温，待对照管凝固后再记录。

实验四 根际细菌对幼苗生长的影响

一、实验原理

许多研究表明，植物根际普遍存在着一些对植物生长有促进和保护作用的微生物，且以细菌为主，统称为根际促生细菌（PGPR）。这些细菌可通过多种机制促进植物生长、增加作物产量。本实验以玉米为研究材料，玉米幼苗生长的考察指标主要有出苗数、株高、根数、生物量等，本实验通过考察所分离根际细菌对这些指标的影响，进一步评价所分离菌株对玉米幼苗是否有促生长作用。

二、实验用品

1．供试菌株

实验一分离纯化的菌株。

2．器材

光照恒温培养箱、滤纸（直径9cm）、离心管、纱布、直尺、移液器、接种环等

3．培养基

NBRIP固体培养基

三、实验步骤

1、种子催芽: 将玉米种子冷水浸泡半小时后，用湿纱布包裹放置于25-28℃恒温培养箱中催芽，待种子露白后用。

2、菌悬液的制备

挑取分离筛选到的解磷菌株，无菌操作划线接种到NBRIP平板上，28℃培养24-48小时, 刮取5-8环NBRIP平板上的菌苔重悬于10ml无菌水中，轻轻振荡使之混合均匀得菌悬液。

3、平皿促生

每一无菌平皿中（含滤纸）放置经挑取的饱满且发芽一致的玉米种子约6粒，并加入菌悬液3ml，再补10ml无菌水，以加等量（13ml）无菌水的处理作为对照，25-28℃培养约7-14天后，测定玉米幼苗的发芽率、根长、茎长、根数及干鲜重。培养期间定期加入定量的无菌水，以维持种子正常发芽生长，每一菌株设置至少3个平皿重复。

4、观察测量结果

测定玉米幼苗的发芽率、根长、茎长、根数及干鲜重。