枯草芽孢杆菌胞外淀粉酶高产菌株的选育
实验方案
实验一 紫外诱变及高产菌株的初筛
（一）实验目的
通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
（二）实验材料与用品
菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)；
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机。
（三）实验内容与方法
（1）菌悬液的制备
a) 取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
b) 将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
c) 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108个。
（2）平板制作
将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55℃左右时倒平板，凝固后待用。
（3）紫外线处理
a) 将紫外灯开关打开预热约 20分钟。
b) 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
c) 将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W的紫外灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
（4）稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10 倍稀释法稀释成 10-1-10-6（具体可
按估计的存活率进行稀释）。
（5）涂平板取 10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3只，每只平板加稀释菌液0.1 ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
（6）培养
将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养 48 小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
（7）计数
将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。
（8）观察诱变效应
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落转接到试管斜面上培养。
（四）实验作业
记录实验数据，分析实验结果并进行讨论，撰写实验报告。
实验二 高产菌株的鉴定
（一）实验目的
1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法；
2．从初筛所获得的诱变菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。
（二）实验原理
淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。α-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。
淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
（三）实验用品
1．粗酶液
实验一保存的HC比值大的菌落进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。
2．试剂
碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中；
比色用稀释碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中；
2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml，需当天配制；
pH6.0的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；
0.5mol/L乙酸溶液。
3．器材
离心机，分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表，试管，移液管，烧杯，离心管。
（四）实验方法
1．标准曲线的绘制
表2－1标准曲线的制作
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试 剂 |
管号 |
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
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淀粉稀释液浓度/% |
0 |
0.2 |
0.5 |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
|
淀粉稀释液/ml |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
缓冲液/ml |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
40℃水浴中保温5min |
||||||
|
蒸馏水/ml |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
40℃水浴中保温30min，加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀后吸取反应液1ml |
||||||
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稀碘液/ml |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
|
A660 |
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将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；
吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温15min；
加蒸馏水1ml，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml；
吸取反应液1ml，加入稀碘液10ml，混匀，在660nm下测吸光值A；
以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
2．酶液的制备
将发酵液离心（5000r/min，10min），取上清液作为粗酶液，以pH6.0缓冲液稀释至适当浓度，作为待测酶液。
3．淀粉酶活力测定
按下列程序操作：
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试管A（空白） |
试管B（酶试样，需作三个平行试样） |
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↓ |
↓ |
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加2%淀粉稀释液2.00ml |
加2%淀粉稀释液2.00ml |
|
↓ |
↓ |
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加缓冲液1.00ml（摇匀） |
加缓冲液1.00ml（摇匀） |
|
↓40±0.2℃，5min |
↓40±0.2℃，5min |
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加蒸馏水1.00ml（摇匀） |
加粗酶液1.00ml（摇匀） |
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↓40±0.2℃，30min |
↓40±0.2℃，30min |
|
加乙酸10.0ml |
加乙酸10.0ml |
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↓混匀 |
↓混匀 |
|
取反应液1.00ml |
取反应液1.00ml |
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↓ |
↓ |
|
加稀碘液10.00ml |
加稀碘液10.00ml |
|
↓混匀 |
↓混匀 |
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测定A660 |
测定A660 |
计算酶活性：
酶活力单位的定义：1 ml酶液在40℃、pH 6.0的条件下，每小时分解的淀粉的毫克数。表示为U/ml。
（五）注意事项
1．淀粉一定要用少量冷水调匀，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。
2．酶液应该进行适当稀释。
（六）作业
1．绘制标准曲线。
2．记录各样品的A660，并计算其酶活力。
（七）思考题
1．测定酶活力时，在具体操作上应注意哪些问题？
2．为什么测定酶活力的试剂要在40℃水浴锅中预热？